使用方法

1、原代
（1）取材后的組織須放在預(yù)冷的（2-8°C）組織保存液 E 的取樣瓶中，快速轉(zhuǎn)運(yùn)至潔凈實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織處理和細(xì)胞分離，拍照并登記信息。
（2）準(zhǔn)備若干培養(yǎng)皿，加入 4℃預(yù)冷的原代培養(yǎng)緩沖液 B 備用。
（3）取樣瓶消毒，將組織放入培養(yǎng)皿中，利用原代培養(yǎng)緩沖液 B 清洗三次后，利用眼科jian或手術(shù)dao將組織jian切成體積約為 1-3mm3 的組織塊。
（4）組織用人乳腺癌原代組織消化ye C 消化，37℃震蕩消化10-20min，（消化過程中隨時(shí)觀察消化情況）。
（5）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個(gè)細(xì)胞或 70um 以下的細(xì)胞簇后，加入三倍體積原代培養(yǎng)緩沖液 B 終止消化。
（6）使用100um孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，將濾液收集后，于300g富集離心5min后移去上清，添加原代培養(yǎng)緩沖液 B 重新重懸離心。
（7）基質(zhì)膠計(jì)算：第6步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠（abs9495）重懸鋪板。
（8）24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點(diǎn)膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進(jìn)行鋪板（4℃下操作）。
（9）將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加人乳腺癌類器官培養(yǎng)基 A（恢復(fù)室溫）進(jìn)行培養(yǎng)。
2、類器官傳代培養(yǎng)
（1）移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G 放置2min。
（2）移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）
（3）a：類器官數(shù)量不足或體積較小時(shí)： 離心5min棄去上清，添加適量類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G 重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進(jìn)行第4步。
        b：類器官數(shù)量較多或體積較大時(shí)：離心5min棄去上清，添加適量類器官傳代消化液 D 消化2-3min，添加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G 終止消化，離心5min棄去混合液，添加適量類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G 重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進(jìn)行第4步。
（4）類器官收集后，添加基質(zhì)膠重懸，每孔25ul基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中10-15min添加500ul人乳腺癌類器官培養(yǎng)基 A。
3、類器官凍存
（1）移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G 放置2min。
（2）移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）
（3）離心5min棄去上清，添加適量類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G 再次重懸，300g離心5min棄去液體。
（4）添加適量類器官凍存液 F，輕柔吹打重懸，以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例：密度為2個(gè)孔凍存1管，每管體積1.4ml。
（5）做好標(biāo)記信息，進(jìn)行程序降溫后，移入液氮長期保存。
4、類器官復(fù)蘇
（1）取10ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G 于15ml離心管中。
（2）從液氮罐中取出凍存的類器官細(xì)胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。
（3）水浴融解過程中，需輕輕搖動(dòng)冷凍管，以確保凍存液在 1-2min內(nèi)融解。
（4）將溶解后的類器官細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移至15ml 離心管，使用移液管輕輕吹打6-8次，300g 離心 5min，然后除去上清液并收集類器官細(xì)胞沉淀。添加適量類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G 重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。
（5）基質(zhì)膠重懸，每孔25ul基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加500ul人乳腺癌類器官培養(yǎng)基 A。